膠原誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎方案（CIA）

膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎與人類風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎具有共同的免疫學(xué)和病理學(xué)特征，因此CIA模型被廣泛應(yīng)用于研究致病機(jī)理及治療方法的研究。盡管關(guān)節(jié)炎模型是可復(fù)制的，但要成功誘導(dǎo)高發(fā)病率和嚴(yán)重程度的關(guān)節(jié)炎，一些影響造模因素需要考慮。

以下是成功誘發(fā)小鼠關(guān)節(jié)炎的一些重要因素。在造模之前，特別是對于造模者，這些因素需要提前考慮到。然而，正如其它生物模型，不同研究單位的方案有所不同，因此，每個(gè)研究者需要確定自己的研究方案。

動(dòng)物管理與飼養(yǎng)

動(dòng)物必須是7-8 周齡健康的并在SPF條件下飼養(yǎng)的動(dòng)物。一般來說，對于腸道菌群，不管是否致病都顯著影響宿主對抗原的免疫應(yīng)答。濾過性毒菌和細(xì)菌感染也會(huì)影響機(jī)體對膠原的免疫應(yīng)答及關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。例如：感染肝炎病毒（MHV）的小鼠，不能夠誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。飲食也會(huì)影響關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和嚴(yán)重程度，CIA在飼喂不同飲食的小鼠中差異很大。飼喂高脂肪的食物更容易引起高發(fā)病率和嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎。

小鼠品系

小鼠對CIA的易感性與MHC-Ⅱ類分子相關(guān)，同時(shí)也取決于接種二型膠原的小鼠品系。有兩個(gè)小鼠品系被廣泛應(yīng)用，因?yàn)檫@兩個(gè)品系對CIA高度易感。一個(gè)是DBA/(H-2q)小鼠，對雞 牛 豬和人二型膠原有免疫應(yīng)答，另一個(gè)品系B10.RⅢ(H-2r)小鼠，對牛和豬的二型膠原有免疫應(yīng)答，對雞和人二型膠原有較弱的免疫應(yīng)答。兩個(gè)品系對小鼠的二型膠原都有較弱的免疫應(yīng)答，小鼠二型膠原的抗體水平低于關(guān)節(jié)炎抗體水平的1%。因此，如果用小鼠的二型膠原免疫小鼠的話，關(guān)節(jié)炎發(fā)生率約為10%。列表為用于CIA及CAIA 動(dòng)物模型研究的小鼠品系.

另一方面，CIA抗性的小鼠不總是不產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎抗體。zui近研究表明，對CIA的敏感性不僅取決于MHC 類型，同時(shí)CIA抗性的小鼠C57BL/6, 129/Sv (H-2b), and Balb/c (H-2d) ，當(dāng)INF-r 和IL-10 基因敲除后，小鼠能產(chǎn)生針對的關(guān)節(jié)炎自身抗體。這表明，對關(guān)節(jié)炎的敏感性也取決于不同細(xì)胞因子水平。

佐劑

*佐劑對于誘發(fā)小鼠關(guān)節(jié)炎是很重要的。不同于大鼠，用二型膠原加IFA免疫小鼠，不產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎。抗體產(chǎn)生，包括IgG2a抗體對于激活補(bǔ)體及隨后的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生具有重要作用，取決于*佐劑中結(jié)核桿菌的含量。zui近，Campbell 用CFA（5mg/ml）在對CIA抗性的小鼠中成功誘發(fā)高發(fā)病率的關(guān)節(jié)炎（50-70%），例如：C57BL/6, B10, and 129/Sv mice (H-2b). ，*佐劑濃度（結(jié)核桿菌含量）取決于各研究單位動(dòng)物管理委員會(huì)推薦。

膠原

因?yàn)槿ヌ腔哪z原會(huì)影響關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生，同時(shí)一些未去除的雜質(zhì)比如：胃蛋白酶可能會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞刺激試驗(yàn)中產(chǎn)生假陽性，因此Ⅱ型膠原應(yīng)按規(guī)定高度純化。如果按恰當(dāng)?shù)姆椒▋龈傻哪z原-20℃避光保存的條件下，是非常穩(wěn)定的。純化的膠原溶于0.05M濃度的醋酸中，終濃度為2-4mg/mL，溫和攪拌，4℃過夜。膠原溶液在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。Chondrex 公司提供較完整的不同免疫級別的Ⅱ型膠原。

表1 不同種屬來源Ⅱ型膠原

乳劑的制備

1）乳劑的質(zhì)量對于誘發(fā)關(guān)節(jié)炎有至關(guān)重要的重要。乳劑的制備有多種方法。但是不推薦注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導(dǎo)致乳劑不能夠有效的、穩(wěn)定的誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。此外，超聲波處理方法，至少將膠原分成2個(gè)片段，這些小片段在正常體溫下，很容易變性。推薦使用電動(dòng)的高速攪拌器：

用高速攪拌器（帶直徑≤5mm的刀片，Fig.1）攪拌不*佐劑（IFA）和膠原溶液(Fig 2a)。如果刀片夠不到注射器低端，可以把5mL或10mL的注射器從活塞處剪去一半（Fig.2b）。把注射器夾緊，固定在鐵架臺上，并冰浴。zui后一步很重要，因在攪拌過程中會(huì)發(fā)熱，會(huì)引起蛋白變性，變性的蛋白不能夠誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（CIA）。

2）加1體積（zui多2.5mL）*佐劑（不*佐劑在加強(qiáng)免疫時(shí)用到）到注射器，再加等體積的膠原溶液（0.05M醋酸溶解的的膠原溶液，終濃度2mg/mL），邊低速攪拌邊滴入膠原溶液。

３）繼續(xù)混合，直到在zui大轉(zhuǎn)速產(chǎn)生穩(wěn)定的乳液（轉(zhuǎn)速約３0０００rpm/2-3 min）。在再次混合前確保乳液是冰浴中。對于大體積（2-5Ml）為了使乳液混合均勻，建議在混勻過程中移動(dòng)攪拌位置。

注：可能需重復(fù)攪拌2-3次

4)將一滴乳劑滴與一燒杯水中，檢測乳劑的穩(wěn)定性。如果乳劑是穩(wěn)定的，在水中是成團(tuán)的，不散開。

 注：如果乳劑在水面散開，表明乳劑不穩(wěn)定。再加幾滴佐劑，重新混合后，再檢測。

5）將乳劑轉(zhuǎn)移到1mL Hamiton 玻璃注射器。不加建議采用塑料注射器，因?yàn)楹茈y做到一個(gè)準(zhǔn)確的注射劑量。

注1：通過用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器（活塞部向下）。否則很難做到一個(gè)的注射劑量。

注2：建議在乳劑制備好的一小時(shí)內(nèi)，注射完畢。乳劑在在用前一直保持4℃。

免疫部位

在鼠尾根部注射0.1mL(膠原：100μg)乳劑（Fig.4）。例如：從尾根部2cm處插入針頭，直到針尖插入位置距尾根部0.5cm。針插入皮下且每次注射充分擦拭，防止乳液的露出。針頭沿斜向上與鼠尾方向平行插入。如果要加強(qiáng)免疫，注射部位在尾根部3Cm處，針尖插入皮下?lián)笪哺?/span>1.5cm處。

注1：背部皮下注射也非常有效，但需注射更多的膠原乳劑（0.5-1Ml）。

注2：無論如何，我們不建議背部皮下注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑，如初次免疫或加強(qiáng)免疫。因?yàn)椴?佐劑在腹膜和腹腔引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

免疫程序

Ⅱ型膠原的自身IgG抗體水平及其亞型（可激活補(bǔ)體），對關(guān)節(jié)炎的發(fā)生很重要。依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠泻芏喾N方法可誘發(fā)高發(fā)病率的關(guān)節(jié)炎。

1. 通過單次免疫（無加強(qiáng)免疫）誘發(fā)關(guān)節(jié)炎

依據(jù)說明書方法制備乳劑-膠原-*佐劑（4mg/ml）和免疫，對于一些易感品系如DBA/(H-2^q)和B10.RⅢ(H-2^r)，將會(huì)在3.5-4周引發(fā)關(guān)節(jié)炎，6-8周發(fā)病率達(dá)90-100%。關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，臨床評分可達(dá)到10-12分（zui高16分）。

注：由于高濃度的結(jié)核桿菌，一般免疫部位的炎癥程度會(huì)很高。因此，可選用b 或C 方案。 b 通過加強(qiáng)免疫誘發(fā)關(guān)節(jié)炎\

按上述方法制備乳劑和免疫，初次免疫CFA（1mg/ml）。7天或21天后用膠原和不*佐劑加強(qiáng)免疫。尾部皮下注射0.05-0.1ml乳劑，避開初次免疫部位，多點(diǎn)注射。初次免疫后4-4.5周后發(fā)病。6-8周發(fā)病率在80-100%，臨床評分可達(dá)8-12分（zui高16分），比方案A關(guān)節(jié)炎程度少輕。

C 通過LPS加強(qiáng)免疫

LPS和體內(nèi)二型膠原自身抗體水平對于誘發(fā)關(guān)節(jié)炎具有協(xié)同效應(yīng)。此外，經(jīng)典的CIA ，免疫LPS(B細(xì)胞分裂素)或MAM(支原體產(chǎn)生的T細(xì)胞分裂素)或SEB(金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的T細(xì)胞分裂素)后，都會(huì)加強(qiáng)關(guān)節(jié)炎程度。因此這些毒素不僅用于引發(fā)和加強(qiáng)關(guān)節(jié)炎水平而且用于關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)間。。

按方案B,免疫二型膠原和CFA 乳劑。25-28天或在在關(guān)節(jié)炎想發(fā)生的3-5天前腹腔注射LPS(25-50ug)。關(guān)節(jié)炎將在24-48小時(shí)發(fā)生，發(fā)病率90-100%。

D 用高劑量的CFA加強(qiáng)免疫

    對于一些CIA抗性的小鼠，例如：B10 (H-2^b), C57BL/6 (H-2^b), and C57BL/6x129/Sv (H-2b) ，以下方案。按上述方案制備膠原和佐劑（5mg/ml）,尾部注射0.1ml。然而，有必要用高濃度的CFA 加強(qiáng)免疫。21天后，加強(qiáng)免疫，制備膠原和佐劑（5mg/ml）,尾部注射0.1ml。4-6周發(fā)病，6-7周發(fā)病率在50-70%。

臨床評分

關(guān)節(jié)炎可通過臨床評分來定性評估或用測厚儀來測量爪子厚度來評估。這些方法適用于所有的關(guān)節(jié)炎模型比如經(jīng)典的CIA，佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和棉線誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。

表2  關(guān)節(jié)炎炎癥程度的臨床評分